Μυκητιακή και βακτηριακή ποικιλομορφία στο τσάι Pu-erh.

Το Pu-erh είναι ένα τσάι που παράγεται στο Yunnan της Κίνας με μικροβιακή ζύμωση φρέσκων φύλλων Camellia sinensis με δύο διαδικασίες, την παραδοσιακή ακατέργαστη ζύμωση και την ταχύτερη, ώριμη ζύμωση. Ως προϊόν μικροβιακής ζύμωσης, η ασφάλεια του τσαγιού Pu-erh είναι ένα θέμα συνεχούς ανησυχίας. Τοξικοί μικροβιακοί μεταβολίτες διερευνήθηκαν από δείγματα τσαγιού Pu-erh ή απομονώσεις μυκήτων που ανακτήθηκαν από το Pu-erh, αλλά βρέθηκαν ασυνεπή αποτελέσματα στη βιβλιογραφία. Ορισμένες μελέτες δεν ανίχνευσαν μυκοτοξίνες, αλλά άλλες μελέτες ανίχνευσαν μυκοτοξίνες όπως η αφλατοξίνη Β1, η δεοξυνιβαλενόλη και η ωχρατοξίνη. Προηγούμενες μελέτες, ωστόσο, δεν έχουν συσχετίσει τη σύνθεση της μικροβιακής κοινότητας με την παραγωγή δυνητικά τοξικών μικροβιακών μεταβολιτών.

Χρησιμοποιώντας την αλληλουχία επόμενης γενιάς του DNA που απομονώθηκε από το Pu-erh, βρήκαμε πολύ περισσότερα OTU (operational taxonomic unit / λειτουργική ταξινομική μονάδα) σε επίπεδο είδους, 390 μύκητες και 600 βακτήρια, από όσα είχαν εντοπιστεί σε προηγούμενες μελέτες. Για παράδειγμα, οι Tian et al. χρησιμοποίησε και τις εξαρτώμενες από την καλλιέργεια μεθόδους ηλεκτροφόρησης γέλης και τις μεθόδους μετουσιωτικής βαθμίδωσης για να βρει ca. 20 μυκητιακές και 30 βακτηριακές OTU από 19 δείγματα Pu-erh. Οι Zhao et al. χρησιμοποίησε τη μέθοδο της αραίωσης για να βρει 41 είδη μυκήτων από 60 δείγματα Pu-erh. Αρκετοί μύκητες έχουν εντοπιστεί στο τσάι Pu-erh με καλλιέργεια. Ο Aspergillus niger, ένας σημαντικός βιομηχανικός μύκητας, έχει αναγνωριστεί ως η κύρια μούχλα ζύμωσης στην παραγωγή Pu-erh. Βρήκαμε αυτόν τον μύκητα σε όλα τα ακατέργαστα και ώριμα δείγματα Pu-erh και η σχετική αφθονία του ήταν μεγαλύτερη στο ώριμο Pu-erh (δεύτερο πιο άφθονο OTU, 16,1% των αλληλουχιών) παρά στο ακατέργαστο (15ο σε αφθονία OTU, 1,4% των αλληλουχιών). Στο ακατέργαστο Pu-erh, το πιο κυρίαρχο ταξινομικό σύστημα μυκήτων ήταν ένα απροσδιόριστο Aspergillus sp. (24,6%). Στο ώριμο Pu-erh, το πιο κυρίαρχο είδος μυκήτων ήταν το Blastobotrys adeninivorans (46,5%), το οποίο, στο ακατέργαστο Pu-erh, ήταν ο τρίτος πιο άφθονο μύκητας. Ο B. adenivivorans, ένας άλλος μύκητας βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος, έχει συχνά απομονωθεί από το Pu-erh από άλλους ερευνητές. Ορισμένα είδη μυκήτων που αναφέρθηκαν συχνά στο παρελθόν, όπως το Penicillium chrysogenum και το Yarrowia spp, δεν βρέθηκαν στη μελέτη μας. Δεν μπορούμε να πούμε εάν οι διαφορές μεταξύ της προσέγγισής μας επόμενης γενιάς και αυτών των προηγούμενων μελετών οφείλονται σε διαφορές στη βιωσιμότητα των μυκήτων, τον ρυθμό ανάπτυξης, τη διαθεσιμότητα DNA ή την αποτελεσματικότητα ενίσχυσης, αλλά πιθανώς εμπλέκονται και οι τέσσερις πτυχές. Η ατελής βάση δεδομένων αναφοράς που χρησιμοποιείται για την ταξινόμηση ταξινόμησης είναι ένας άλλος σημαντικός παράγοντας επειδή το 38% (148/390) των μυκητιακών OTU δεν μπορούσε να αποδοθεί σε είδη. 

Ένα από τα σημαντικότερα ευρήματά μας είναι ότι η α-ποικιλομορφία των μυκήτων είναι μεγαλύτερη στα φρέσκα φύλλα τσαγιού από ότι στο Pu-erh και ότι η βακτηριακή α-ποικιλομορφία δείχνει την αντίθετη τάση, δηλαδή χαμηλότερη στα φρέσκα φύλλα από ότι στο Pu-erh. Με τα βακτήρια, η διαφορά στην α-ποικιλομορφία μεταξύ των φύλλων και του τσαγιού φάνηκε με το ώριμο, αλλά όχι το ωμό τσάι , υποδεικνύοντας ότι η ζύμωση του στερεού υποστρώματος ήταν υπεύθυνη για την αύξηση.

Ένα δεύτερο σημαντικό εύρημα είναι ότι η σύνθεση τόσο της μυκητιακής όσο και της βακτηριακής κοινότητας αλλάζει σημαντικά λόγω της ζύμωσης του τσαγιού Pu-erh, όπως φαίνεται από σημαντικές διαφορές β-ποικιλότητας τόσο για τις μυκητιακές όσο και για τις βακτηριακές κοινότητες σε ζευγαρωμένες συγκρίσεις μεταξύ φρέσκων φύλλων, ακατέργαστων και ωριμασμένων Pu-erh. Οι λόγοι για αυτές τις διαφορές πρέπει να οφείλονται στα μικρόβια που υπάρχουν στα φύλλα σε σύγκριση με αυτά που αποκτώνται κατά την επεξεργασία και τη ζύμωση. Τα φρέσκα φύλλα περιέχουν αλληλουχίες που αντιπροσωπεύουν περίπου το 54% των μυκητιακών OTU και το 22% των βακτηριακών OTU που βρίσκονται στο Pu-erh. Αυτά τα OTU γενικά υπήρχαν σε χαμηλή αφθονία σε φρέσκα φύλλα και εμπλουτίστηκαν σε Pu-erh. Τα υπόλοιπα μυκητιακά και βακτηριακά OTU που βρίσκονται στο Pu-erh πρέπει να έχουν την προέλευσή τους στις διαδικασίες παραγωγής που επιτρέπουν την εισαγωγή περιβαλλοντικών μικροοργανισμών (π.χ. καλύμματα πασσάλων, δωμάτιο ζύμωσης και χέρια εργαζομένων).

Ένα ενδιαφέρον εύρημα είναι ότι το πιο περιζήτητο τσάι, το παλαιωμένο ακατέργαστο Pu-erh, έχει κοινότητα μυκήτων περισσότερο σαν ώριμο παρά νεαρό ωμό Pu-erh, και παρόμοια τάση παρατηρήθηκε για τη βακτηριακή κοινότητα. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η επιταχυνόμενη μικροβιακή ζύμωση του ωριμασμένου Pu-erh, που ενθαρρύνεται από την προσθήκη νερού και τη θερμότητα που παράγεται από τη μικροβιακή ζύμωση, έχει ως αποτέλεσμα μια σύνθεση μικροβιακής κοινότητας παρόμοια με αυτή που βρίσκεται σε πολύ παλαιότερο, ακατέργαστο Pu-erh. Παρέχει επίσης μια οικολογική εξήγηση για την ταχεία αποδοχή και την ευρεία χρήση της ωριμασμένης διαδικασίας Pu-erh.

Αναζητήσαμε συσχετίσεις μεταξύ τεσσάρων μεταβλητών στην παραγωγή τσαγιού και τη σύνθεση της μικροβιακής κοινότητας, την ηλικία του τσαγιού, τον παραγωγό του τσαγιού, εάν το τσάι ήταν καθαρό ή μολυσμένο με άλλα φυτά και εάν το τσάι αφέθηκε χαλαρό ή συμπιεσμένο σε κέικ. Η ηλικία του τσαγιού έδειξε σημαντική συσχέτιση με τη σύνθεση μυκητιακής και βακτηριακής κοινότητας μόνο για το ακατέργαστο Pu-erh. Από αυτό το αποτέλεσμα, μπορεί κανείς να συμπεράνει ότι το ακατέργαστο Pu-erh είναι μια στιβαρή αλλά χρονοβόρα μέθοδος παρασκευής του προϊόντος και ότι η παρασκευή ώριμης Pu-erh είναι μια πιο απαιτητική διαδικασία, αλλά δεν ωφελείται από τη γήρανση. Αυτό το αποτέλεσμα φαίνεται επίσης να υποστηρίζει την εικασία ότι η μακρά μεταφορά του ακατέργαστου Pu-erh από το Yunnan στο Θιβέτ και σε άλλους απομακρυσμένους προορισμούς στην αρχαιότητα συνέβαλε στην ωρίμανσή του. Η γήρανση δεν επηρεάζει σημαντικά τις κοινότητες του ωριμασμένου τσαγιού, γεγονός που υποδηλώνει ότι το ώριμο τσάι δεν είναι απαραίτητο. Οι άλλες τρεις μεταβλητές δεν είχαν σημαντική επίδραση στις μικροβιακές κοινότητες .

Σχετικά με την ανακάλυψή μας σε ώριμες αλλά όχι ακατέργαστες αλληλουχίες Pu-erh rbcL από Musa, Pinus και Brassica , εικάζουμε ότι προέκυψαν από φυτά ή φυτικά προϊόντα που χρησιμοποιήθηκαν από τους παραγωγούς για την επικάλυψη τσαγιού κατά τη διάρκεια της ζύμωσης στο σωρό για να καθυστερήσουν απώλεια νερού και διατήρηση θερμότητας. Φυσικά, η μόλυνση θα ήταν επίσης δυνατή από τα δάπεδα των χώρων ζύμωσης, τα εργαλεία ή τα υλικά συσκευασίας, καθώς και τη μόλυνση κατά τη συγκομιδή. Δεν μπορέσαμε να προσδιορίσουμε την ποσότητα αυτών των μολυσματικών φυτών στα ώριμα δείγματα Pu-erh, αλλά η μόλυνση δεν ήταν αρκετή για να προκαλέσει σημαντική διαφορά στη σύνθεση της μικροβιακής κοινότητας ή στη γεύση του παρασκευασμένου τσαγιού.

Αν και το τσάι Pu-erh θεωρείται ένα ασφαλές ρόφημα για εκατοντάδες χρόνια, χωρίς αναφορές δηλητηρίασης, η ποιότητα και η ασφάλεια οποιουδήποτε προϊόντος που έχει υποστεί μικροβιακή ζύμωση είναι θέματα συνεχούς ενδιαφέροντος και ανησυχίας. Μεταξύ των ενώσεων που ανιχνεύθηκαν από το Pu-erh σε αυτή τη μελέτη, η πιο συχνά συναντώμενη ήταν το asperglaucide, το οποίο ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα και σε υψηλές ποσότητες σε ακατέργαστα (6596 μg/kg) και σε ώριμα (6799 μg/kg) τσάι. Αυτός ο μεταβολίτης αναφέρεται ότι παράγεται από το Aspergillus spp, συμπεριλαμβανομένου του A. penicillioides, το οποίο ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα. Αναφέρεται επίσης από ορισμένα φυτά, π.χ. το Walsura yunnanensis, αλλά σε κανένα από τα φυτά που ανιχνεύθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Το Asperglaucide αναφέρεται ότι έχει αντιφλεγμονώδη δράση και την ικανότητα να αναστέλλει τις πεπτιδάσες κυστεΐνης, οι οποίες μπορεί να είναι ευεργετικές στην προστασία από τον εκφυλισμό του χόνδρου. Σε όλα τα δείγματα ανιχνεύθηκε επίσης η νεοεχινουλίνη Α, η οποία έχει αντιφλεγμονώδη δράση και μπορεί να παραχθεί από ορισμένα είδη Eurotium. Fumigaclavine A, ένα αντιβακτηριακό αλκαλοειδές που παράγεται από Aspergillus spp. ανιχνεύθηκε μόνο σε ώριμο τσάι, ενώ η λοταουστραλίνη, πρόδρομος του υδροκυανίου, ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα ωμού τσαγιού, αλλά όχι σε δείγματα ώριμης τσαγιού. Το μυκητοκτόνο, που παράγεται από τα Lysobacter capsici και Alternaria alternata, ανιχνεύθηκε στο 60% και 100% των δειγμάτων ωμού και ώριμου τσαγιού, αντίστοιχα, αλλά σε σημαντικά υψηλότερες ποσότητες σε ώριμο τσάι. Αυτή η κατανομή συνέβη και για το rugulusovin, το οποίο παράγεται από την Penicillium spp. και έχει αποδειχθεί ότι έχει κυτταροτοξική δράση κατά των καρκινικών κυττάρων ανθρώπου και ποντικού. Εντοπίστηκε στα μισά από τα ακατέργαστα και όλα τα ώριμα δείγματα, μια κατανομή που μπορεί να εξηγηθεί όχι μόνο από τις διαφορές στο μικροβίωμα, αλλά και από τις διαφορές στις συνθήκες ανάπτυξης μεταξύ των δύο κατηγοριών τσαγιού.

Η πατουλίνη ανιχνεύθηκε στο 60% των ακατέργαστων δειγμάτων με μέση συγκέντρωση 1169 μg/kg και μόνο στο 12,5% των ωριμασμένων δειγμάτων σε μέση συγκέντρωση 915 μg/kg. Η πατουλίνη προκαλεί ανησυχία επειδή παράγεται από μεγάλο αριθμό μυκήτων και υπάρχει υποψία ότι είναι κλαστογόνος, μεταλλαξιογόνος, τερατογόνος, γονοτοξικός και κυτταροτοξικός. Η FDA των ΗΠΑ έχει θέσει ανώτατο όριο 50 μg/kg για την πατουλίνη σε χυμό μήλου και συμπυκνώματα χυμού μήλου. Αν και η συγκέντρωση της πατουλίνης αναμένεται να είναι χαμηλότερη σε ένα φλιτζάνι σωστά παρασκευασμένου τσαγιού από τα περίπου 1000 μg/kg που βρίσκουμε στα ξηρά φύλλα τσαγιού, οι συγκεντρώσεις πατουλίνης στο παρασκευασμένο τσάι αναμένεται να ξεπεράσουν το όριο που έχει ορίσει η FDA . Η ασυμφωνία μεταξύ των ευρημάτων μας για υψηλή συγκέντρωση πατουλίνης και της υγιούς φήμης που απολαμβάνει ο Pu-erh μπορεί να εξηγηθεί από τη ρύθμιση της τοξικότητας της πατουλίνης μέσω της δράσης των πολυφαινολών του πράσινου τσαγιού.

Αν και εντοπίσαμε πατουλίνη στο Pu-erh, δεν γνωρίζουμε την πηγή της. Γνωστοί παραγωγοί πατουλίνης είναι το Penicillium spp. (P. expansum, P. griseofulvum, P. carneum, P. glandicola, P. coprobium, P. vulpinum, P. clavigenum και P. concentricum), Aspergillus spp. (A. clavatus, A. giganteus και A. terreus), Paecilomyces variotii και Byssochlamys nivea. Ωστόσο, κανένα από αυτά τα είδη δεν εντοπίστηκε στα δείγματα τσαγιού μας. Επομένως, είναι πιθανό να υπάρχουν είδη στο τσάι που δεν έχουν ακόμη αναφερθεί ότι παράγουν πατουλίνη. Αντίθετα, βρήκαμε είδη μυκήτων που αναφέρθηκαν ότι παράγουν ωχρατοξίνη Α (Aspergillus niger σε όλα τα δείγματα και A. ochraceus σε έξι από τα ώριμα δείγματα), αλλά δεν ανιχνεύθηκε ωχρατοξίνη Α. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με τους Mogensen et al., οι οποίοι δεν βρήκαν περιεκτικότητα σε ωχρατοξίνη Α σε πέντε τσάγια Pu-erh που ερευνήθηκαν, αλλά διαφορετικά από τους Haas et al. , ο οποίος ανίχνευσε ωχρατοξίνη Α σε τέσσερα από τα 36 δείγματα Pu-erh. Στην παρούσα μελέτη, μια μικρή ποσότητα ζεαραλενόνης ανιχνεύθηκε μόνο σε ένα δείγμα, ενώ δεν ανιχνεύθηκαν αφλατοξίνη, φουμονισίνες ή τριχοθεκένια. Οι Haas et al. δεν βρήκαν αφλατοξίνες ή φουμονισίνες στα 36 δείγματα Pu-erh που δοκιμάστηκαν. Οι Wu et al. διερεύνησαν 70 δείγματα Pu-erh και διαπίστωσαν ότι όλα τα δείγματα τσαγιού ήταν ασφαλή όσον αφορά την τοξίνη φουμονισίνης Β1 και Τ-2, ωστόσο, 8 δείγματα εμφάνισαν υψηλότερες συγκεντρώσεις αφλατοξίνης Β1 από το όριο ασφαλείας και 63 δείγματα υπερέβησαν το όριο ασφαλείας για δεοξυνιβαλενόλη. Μια εξήγηση για την εύρεση μυκήτων ικανών να παράγουν μυκοτοξίνες, αλλά δεν ανιχνεύουν τις ίδιες τις τοξίνες, μπορεί να βρεθεί σε μια πρόσφατη αναφορά ότι τα εκχυλίσματα τσαγιού ανέστειλαν την παραγωγή αφλατοξίνης από τον Aspergillus flavus ενώ δεν ανέστειλαν την ανάπτυξη των μυκηλίων του μύκητα. Αναστολή της παραγωγής μυκοτοξίνης χωρίς αναστολή της ανάπτυξης των μυκήτων αναφέρθηκε επίσης για φυτά εκτός του τσαγιού. Αυτή η κατάσταση μπορεί να ισχύει και για την ωχρατοξίνη. Όπως σημειώθηκε παραπάνω, για να πίνετε Pu-erh με ασφάλεια, οι περισσότεροι παραγωγοί ή διανομείς του τσαγιού Pu-erh συνιστούν την απόρριψη του πρώτου παρασκευάσματος, μια πρακτική που μπορεί να συνιστάται για την απομάκρυνση των υδατοδιαλυτών ή αιωρούμενων ρύπων.

Συμπεράσματα 

Η αλληλουχία επόμενης γενιάς αποκάλυψε υψηλή μυκητιακή και βακτηριακή ποικιλομορφία στο τσάι Pu-erh. Η ποικιλότητα των μυκήτων μειώνεται και η ποικιλότητα των βακτηρίων αυξάνεται ως αποτέλεσμα της ακατέργαστης ή ώριμης ζύμωσης. Η σύνθεση των μικροβιακών κοινοτήτων αλλάζει σημαντικά μεταξύ των φρέσκων φύλλων, ωμά και ώριμα Pu-erh με το παλαιωμένο ωμό τσάι να έχει παρόμοια κοινότητα με το ώριμο τσάι. Η ηλικία του τσαγιού αναγνωρίζεται ως μια σημαντική μεταβλητή που επηρεάζει τη μικροβιακή κοινότητα του ωμού τσαγιού, αλλά όχι του ωριμασμένου τσαγιού. Πολλαπλές μυκοτοξίνες ανιχνεύθηκαν από μία ή και τις δύο κατηγορίες Pu-erh, αλλά όλες εκτός από την πατουλίνη και το asperglaucide ήταν κάτω από το όριο ασφαλείας. Για ασφαλή κατανάλωση, συνιστούμε να απορρίψετε την πρώτη παρασκευή.

Παρατήρηση Health Tea Path : 

1.  Πολλές φορές συνιστάται να απορρίπτεται και η δεύτερη (σύντομη) παρασκευή, ειδικά στο ώριμο Pu-erh. 

2.  Η αγορά τσαγιών από μεγάλα και επώνυμα εργοστάσια θεωρείται ασφαλέστερη, μια και σ΄ αυτά επικρατούν ελεγχόμενες συνθήκες υγιεινής.

ΕΠΙΛΟΓΕΣ   ΚΑΙ   ΠΡΟΣΑΡΜΟΓΗ      :                                              

ΠΗΓΗ   :                                                     
                                                                       

Οι πληροφορίες είναι πολύτιμες για κοινή χρήση,  εάν υπάρχουν προβλήματα πνευματικών δικαιωμάτων,   επικοινωνήστε για διαγραφή.